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常用生物染色劑--考馬斯亮藍(lán)
瀏覽次數(shù):8480發(fā)布日期:2012-07-09

考馬斯亮藍(lán)有G250和R250兩種,在顏色索引(Colour Index)中給出了不同的編號(42655和42660)。亮藍(lán)G和亮藍(lán)R在冷水中分別為微溶和不溶,在熱水和乙醇中分別為可溶和微溶。兩種染料均能對固定的蛋白進(jìn)行有效地染色,使用濃度為溶于甲醇:冰醋酸:水(50:10:40)的0.05%溶液??捡R斯亮藍(lán)G250與蛋白質(zhì)的結(jié)合反應(yīng)十分迅速,是常用的蛋白染料,染色后為藍(lán)綠色,常用來作為蛋白質(zhì)含量的定量測定??捡R斯亮藍(lán)R250與蛋白質(zhì)結(jié)合雖然比較緩慢,但是燃料可以穿透凝膠,染膠效果好,染色后為紅藍(lán)色,且可以被洗脫下去,所以可以用來對電泳條帶染色。G250也可染膠,但染色過程慢且染色后背景高,脫色困難。

 
考馬斯亮藍(lán)R250(Coomassie brilliant blue R-250)為三苯基甲烷(triphenylmethane),每個分子含有兩個SO3-H基團(tuán),本身偏酸性,磺酸基與蛋白質(zhì)的堿性基團(tuán)結(jié)合形成染料-蛋白質(zhì)復(fù)合物。MW=824,λmax=560-590nm。考馬斯亮藍(lán)R-250是通過范德瓦爾鍵與蛋白質(zhì)結(jié)合,可以被洗脫下去,尤其適用于SDS電泳微量蛋白質(zhì)染色,染色靈敏度比氨基黑高5倍。它與不同蛋白質(zhì)結(jié)合呈現(xiàn)出基本相同的顏色,并且在比較寬的范圍內(nèi)(15-20g),掃描峰的面積與蛋白量呈線性關(guān)系。但蛋白質(zhì)濃度超出一定范圍時,對高濃度蛋白的染色不符合Beer定律,用作定量分析時要注意這點(diǎn)。
 
考馬斯亮藍(lán)G250(Coomassie brilliant blue G-250)為二甲花青亮藍(lán)(xylene cyanine brilliant blue),是一種甲基取代的三苯基甲烷。比考馬斯亮藍(lán)R250多二個甲基,MW=854;λmax=590-610nm,游離狀態(tài)下呈紅色。染色靈敏度不如R250,但比氨基黑高3倍。其優(yōu)點(diǎn)在于它在三lvyisuan中不溶而以膠體形式存在,能選擇性地和蛋白質(zhì)形成復(fù)合物,染色迅速,著色深的蛋白質(zhì)區(qū)帶在數(shù)秒內(nèi)即可顯現(xiàn)出來,約45分鐘后著色zui深,成本低,重復(fù)性好。當(dāng)它與蛋白質(zhì)結(jié)合后變?yōu)榍嗌?,蛋白質(zhì)-色素結(jié)合物在595nm波長下有zui大光吸收。其光吸收值與蛋白質(zhì)含量成正比,因此可用于蛋白質(zhì)的定量測定。蛋白質(zhì)與考馬斯亮藍(lán)G-250結(jié)合在2min左右的時間內(nèi)達(dá)到平衡,完成反應(yīng)十分迅速;其結(jié)合物在室溫下1h內(nèi)保持穩(wěn)定。該法是1976年Bradford建立,試劑配制簡單,操作簡便快捷,反應(yīng)非常靈敏,靈敏度比Lowry法還高4倍,可測定微克級蛋白質(zhì)含量,測定蛋白質(zhì)濃度范圍為0~1,000μg/mL,是一種常用的微量蛋白質(zhì)快速測定方法。
 
考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)含量流程
  該方法用于大多數(shù)蛋白質(zhì)的定量是比較的,但不適用于小分子堿性多肽的定量。如核糖核酸酶或溶菌酶。去污劑的濃度超過0.2%影響測定結(jié)果。如TritonX-100、SDS、NP-40等。
  1.Bradford濃染液的配制:將100rug考馬斯亮藍(lán)G-250溶于50m1 95%乙醇,加入100ml濃磷酸,然后,用蒸餾水補(bǔ)充至200ml,此染液放413至少6個月保持穩(wěn)定。
  2.標(biāo)準(zhǔn)曲線蛋白質(zhì)樣本的準(zhǔn)備:盡量使用與待測樣本性質(zhì)相近的蛋白質(zhì)作為標(biāo)準(zhǔn)品,例如測定抗體,可用純化的抗體作為標(biāo)準(zhǔn)。如果待測樣本是未知的,也可用抗體作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。通常在20ug—150ug/100ul之間繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
  3.將待測樣本溶于100~1緩沖溶液中,該緩沖溶液應(yīng)與制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的緩沖溶液相同(用PBS)。
  4.按1:5用蒸餾水稀釋濃染料結(jié)合溶液,如出現(xiàn)沉淀,過濾除去。
  5.每個樣本加5ml稀釋的染料結(jié)合溶液,作用5~30rain。染液與蛋白質(zhì)結(jié)合后,將由紅色變?yōu)樗{(lán)色,在595nm波長下測定其吸光度。注意,顯色反應(yīng)不得超過30min.
  6.根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算待測樣本的濃度。
考馬斯亮藍(lán)和皮膚中蛋白質(zhì)通過范德華力結(jié)合,反應(yīng)快速,并且穩(wěn)定,無法用普通試劑洗掉。待一兩周左右,皮屑細(xì)胞自然衰老脫落即可無礙。
 
考馬斯亮藍(lán)R-250是電泳的
考馬斯亮藍(lán)G250和R250都可以染蛋白,一般用R250,G250染色后背景較深不易脫色。 一般R250 染蛋白,G250 一般測蛋白濃度,也可染膠,敏感性更高但較慢脫色較難。

考馬斯亮藍(lán)G250常用的蛋白染料,作定性試驗用,染色后為藍(lán)綠色;R250較敏感,做定量實(shí)驗用,染膠效果較好.染色后為紅藍(lán)色 。
 

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